Efter pestepidemierne i 1700-tallet, slog de københavnske kirkegårde ikke til.
Man var nødt til at lave nødkirkegårde imellem husene, de såkaldte assistancekirkegårde. Her blev især de fattigste begravet.
Det var dog ikke nogen løsning på længere sigt, så i 1757 besluttede man at anlægge en stor assistenskirkegård ved Nørrebrogade udenfor voldene på Nørre Fælled. Den åbnede i 1760. På området havde der tidligere ligget en tobaksplantage.
Befolkningen i byen var dog ikke meget for at skulle begraves så langt væk, selv om prisen kun var en femtedel af, hvad det kostede at blive begravet inde i byen. Først da den fornemme københavnsk etatsråd J. S. Augustin i 1785 lod sig begrave herude, blev Assistens Kirkegård mere populær.
I begyndelsen omfattede kirkegården kun et smalt stykke langs Kapelvej, men efterhånden blev den udvidet, så den strakte sig helt ud til Jagtvej. Hertil nåede den i 1805. Senere var yderligere udvidelser nødvendige, da det i 1851 blev forbudt at begrave de døde indenfor de gamle volde omkring København. Istedet blev der indrettet afdelinger på Assistens Kirkegård for de enkelte kirker i Københavns Indre by.
Hele kirkegården var omgivet af en to meter høj mur, som holdt dyr ude. I muren er der flere steder porte, der er tegnet af Københavns stadsbygmester Peter Meyn (1749-1808).
Kirkegårdens kapel blev opført omkring 1867 efter tegning af arkitekt Niels Sigfred Nebelong (1806–1871). Det har givet navn til Kapelvej. Det bruges ikke længere til sit oprindelige formål, men rummer siden 1993 Kulturcentret Assistens.
Tæt på Nørrebros Runddel lå tempellignende bygning, der blev opført i 1808 som ligstue og graverbolig. Den var tegnet af københavns viceborgmester Jens Bang. Han var ikke færdiguddannet arkitekt, hvad der måske ses af de meget tætstående søjler, der gjorde det vanskeligt at bære en kiste ud gennem døren. Bygningen er nedrevet.
Den sydligste del af kirkegården var i 1800-tallet udlagt til begravelser for lemmerne på Københavns Ladegård og blev desuden i 1853 brugt til at begrave ofre for kolera-epidemien. Denne del blev nedlagt og fra 1909 omdannet til Hans Tavsens Park.
Assistens Kirkegård har en række gravminder for kendte personer, f.eks. H. C. Andersen, H. C. Ørsted og Søren Kierkegaard.
I forbindelse med anlægget af metrostationen ved Nørrebros Runddel, blev en række grave nedlagt og kisterne flyttet til en anden del af kirkegården.