Kirken blev påbegyndt i 1630’erne på en grund som var købt til formålet i 1622.
Kong Christian den 4. var på denne tid i færd med at udbygge Københavns Universitets bygninger, og ville også opføre en kirke for de ansatte og studenterne på Regensen.
Grundstenen blev lagt i 1637, men kirken var først færdig omkring 1652. Tårnet var dog færdigbygget i 1642.
Der var flere bygmester involveret i byggerier, bl.a. Hans van Steenwinckel (den yngre).
Kirken blev viet til den hellige treenighed (trinitatis på latin): Faderen, Sønnen og Hellighånden.
Kirken er især kendt for sit markante tårn, Rundetårn. På grund af tårnets særlige funktion som astronomisk observatorium, kunne det ikke fungere som klokketårn. I stedet fik kirken et spir, hvor klokkerne sad. Spiret styrtede sammen og ned i kirken under branden i København i 1728, men blev erstattet at tre andre spir.
På kirkens loft blev der plads til Universitetsbiblioteket og i tårnet blev der indrettet et astronomisk observatorium. Salen med biblioteket rummede desuden den kongelige bogsamling.
For at have plads nok til biblioteket, fik salen en anseelig længde, som også afspejles i kirkerummet, der er ca. 50 meter langt.
I 1861 blev både bibliotek og observatorium flyttet til Østervold omkring Rosenborg Slot.
Efter byggeriet i Ny København, som ikke fra starten fik nogen sognekirke, blev Trinitatis kirke i 1869 almindelig kirke for menigheden i dette område. I 1872 åbnede dog Sankt Pauls Kirke i Trinitatis Sogns nordlige distrikt og ti år tidligere havde Nørrebro, som også oprindeligt hørte til sognet, fået sin egen kirke Sankt Johannes Kirke.
På sydsiden af kirken ligger Trinitatis Kirkeplads, hvor der indtil 1851 lå en kirkegård. Den blev lukket, fordi man forbød begravelser i den indre by. På tegningen øverst på siden, ses pladsen tegnet af L. Both i 1749.
Kirkes altertavle er fra 1731 og udført af billedskæreren Friederich Ehbisch (1672-1748), som også har lavet prædikestolen.
I koret hænger en maleri af Anton Dorph, der viser Jesus der velsigner disciplene. Billedet er fra 1873.
Et andet maleri er udført af Hendick Krock (1671-1738) og viser Jesus på korset. Maleriet er måske en kopi af en ældre altertavle fra kirkesalen i Vartov Hospital.
Døbefonten er et arbejde i marmor af billedskæreren Didrik Gercken.
I kirkens kor er der et gravminde for feltmarskal Hans Schack, som var med i forsvaret af København under svenskernes belejring i krigen 1658-1659.
Under kirken er en krypt, hvor der er en række begravelser. Én af de gravlagte er arkitekten Laurids de Thurah, som der er en mindeplade for inde i kirken.
